用細胞刮刀實驗時

　　實驗步驟：無菌條件下取新生小牛大腦皮層灰質部，4℃D-Hank′s液洗滌4次，至無血迹殘留。剪成1mm3左右的組織碎塊並置於玻璃勻漿器内，加入兩倍體積的MEM培養基，勻漿上下20次？勻漿液先用100目（直徑149μm）尼龍網布式漏鬥抽濾，培養基洗滌4次，收集濾液。然後用200目（直徑74μm）尼龍網布式漏鬥抽濾，MEM培養基洗滌4次。細胞刮刀收集200目尼龍網上的組織（即牛腦微血管），将其置於離心管中，1500r/min離心洗滌10min。離心洗滌的腦微血管懸浮於的0.1%膠原酶中
，旋渦振蕩15sec以充分混勻，置於37℃恒溫振蕩水浴箱中振蕩消化50min？取出後旋渦振蕩15sec，1500r/min離心10min，棄上清，用20%BCS的培養基懸浮
，接種於明膠鋪被的培養瓶中（培養瓶中加入1%明膠-D-Hank′s液洗滌3ml，37℃孵箱中放置24h，用前倒掉明膠溶液即得明膠覆蓋的培養瓶），置於細胞培養箱中，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養。靜置5～7天後，可見少量細胞生長，20%BCS的MEM培養液換液，以後每2～3天換液一次
，至細胞長成緻密單層後可傳代培養
。

　　1、提前準備(bèi)好Matrigel（BD 354277）包被過(guò)的六孔闆，吸棄孔内包被液，加入2ml BeYaMATM 1*培養液。

　　2、吸棄待傳(chuán)代hESCs/hiPSCs孔内的培養液，並(bìng)用1ml無鈣鎂的PBS洗1遍。

　　3、加入0.5ml Accutase細胞分離(lí)液使之*覆蓋(gài)皿底。

　　4、室溫孵育5-8分鍾或37℃孵育3-5分鍾，顯微鏡下觀(guān)察到大部分克隆細胞間出現間隙，細胞表面發(fā)亮但尚未相互分離時，可吸去Accutase。

　　5、可将培養闆放置37℃繼續孵育1min,或者直接加入适量新鮮BeYaMATM 1*培養液，輕輕搖晃，幹(gàn)細胞集落基本脫落。亦可用細胞刮刀将剩餘克隆輕輕刮下，盡量避免用槍頭反複(fù)吹打細胞。

　　6、将制備(bèi)好的細胞懸液按1：3-1：6的比例接種至準備(bèi)好的培養闆中，注意細胞過密則克隆邊(biān)界不圓滑，易分化，細胞過稀則克隆存活率降低。

　　7、輕(qīng)輕(qīng)搖晃培養闆讓細胞均勻分散，置於(yú)37℃，5%CO2培養箱中培養8小時。

　　8、每天更換培養液，待細胞密度達到80%以上，或者克隆中央密度過大，影響細胞生長(zhǎng)時進行傳(chuán)代。