細(xì)胞培養的常見(jiàn)污染原因及其預防

　　如何保持無菌，是每個細胞培養實驗室一直面對的難題。污染幾率增加的主要原因包括：操作技術不嚴格，試劑質量不達标，大氣中孢子計數增加，培養箱或操作台使用和維護不當，污染瞭(le)的冰箱和水浴鍋。因此，在細胞培養過程中，操作者不僅要嚴格遵守标準的操作程序，同時還要特别注意新産品、新品牌、以及設備(bèi)的清潔維護。

　　細胞作爲重要的實驗模型廣泛應用於(yú)各類生物實驗,幾乎所有科研實驗室中都需進行細胞培養。細胞培養過程中最大的威脅就是細胞污染,凡是混入細胞培養環境中,對細胞生存有害的成分和造成細胞不純的異物都應視爲污染。細胞一旦遭到污染,所有的實驗結果都會變得毫無意義。因此,及時檢測並(bìng)鑒定出所培養的細胞是否被污染至關重要。

　　污染來源

　　細胞培養實驗室要求保持無菌操作，避免微生物及其他有害因素的影響。細胞培養室要相對封閉(bì)，潔淨無塵，設有緩沖間。對實驗室進行定期清掃
、紫外消毒是避免細胞培養過程中由於(yú)實驗室環境引起細胞污染的主要措施，此外，實驗室内不要放太多雜物，保持實驗室幹燥，有利於(yú)降低因實驗室條件引起的細胞污染率。

　　細胞培養過程中實驗人員是否操作規範，是否嚴格遵守無菌工作流程，是細胞污染的一個主要因素。操作人員進培養室前，必須先洗手，在緩沖間換穿專用實驗服和拖鞋，嚴禁在實驗進行時頻繁出入培養室。實驗後應将實驗産(chǎn)生的廢物和廢液及時清理出培養室，並(bìng)清潔無菌工作台。

　　常見污染原因

　　1、細菌、真菌污染

　　細菌和真菌污染很容易被檢測(cè),因爲受到細菌、真菌污染的細胞,培養過程中培養基會出現肉眼可見的明顯特征。細菌污染會導緻培養基出現渾濁、顔色改變(biàn)以及pH值急劇變(biàn)化,受污染的貼壁細胞在幾天内會逐漸脫壁死亡
。真菌污染後的細胞生長速度變(biàn)慢,培養基中會漂浮白色、淺黃色或黑色的小點。因此,通過觀察培養基的顔色、漂浮物、pH值或在顯微鏡下觀察細胞及其生長狀态,從而能初步判斷該細胞是否受細菌、真菌污染。也可以使用培養檢測(cè)法：将細胞培養物在各類培養基中适溫培養若幹天後,觀察是否有細菌或真菌生長。

　　2、支原體污染

　　支原體污染會影響細胞的形态、功能、代謝、細胞膜、生長(zhǎng)速率
、誘導染色體畸變(biàn)、細胞内信号傳導等各種細胞特性。受支原體污染的細胞在培養時培養基的pH值不會發生改變(biàn),也不會渾濁,因此,很難直接觀察出細胞是否受到污染。

　　常用的支原體檢測(cè)DNA熒光染色法：使用熒光染料DAPI或Hoechst33258染色，熒光染料能選擇性的結合細胞和支原體DNA的小溝,因此,在準備(bèi)過程中,任何存在的DNA均會被染色
。被支原體污染的細胞經染色後,細胞核外與細胞周圍可看到許多大小均一的熒光點。

　　3、黴菌污染

　　黴菌污染早期
，應用PBS多次沖(chōng)洗細胞，盡量将孢子洗掉，然後用兩性黴素處理。兩性黴素對細胞生長(zhǎng)影響也很大，濃度過高可緻細胞死亡，濃度過低時則不能抑制黴菌生長(zhǎng)。

　　4、病毒污染

　　有關病毒污染的資料不多，但一般認爲病毒污染不影響細胞培養，通過PCR技術可以檢測(cè)。不過病毒污染對生産(chǎn)疫苗是不安全的。因此，至今，潛在病毒是細胞大量生産(chǎn)和疫苗、幹擾素等生物制品制作的難題。有研究顯示用伽馬射線可清除牛血清的大部分病毒，現如今值得期待的是下遊工藝中除病毒過濾器的開發。

　　結合文獻報(bào)道和本人的實際經驗認爲，在細胞培養過程中，潛在的污染途徑主要包括操作技術和環境，其中環境因素又包括瞭(le)無菌試劑和材料、超淨工作台、恒溫恒濕培養箱、水浴鍋和冰箱等。

　　一、操作技術

　　培養(yǎng)操作前——

　　⑴個人衛生：進入細胞培養室時應更換實驗室專用鞋或者穿鞋套；穿戴實驗服、口罩和手套，用消毒酒精（75%濃度的乙醇）擦拭雙手；如果操作者是長(zhǎng)發，應紮於(yú)腦後。

　　⑵工作台準備(bèi)：提前0.5~1h打開超淨台的紫外燈進行消毒；用蘸有消毒酒精的紙巾擦拭超淨台的台面
、擋(dǎng)闆等。

　　⑶試劑準備：從冷藏室或冷凍室取出所需的培養基等試劑，於(yú)37℃水浴鍋中進行加熱；加熱後用消毒酒精擦拭瓶身，並(bìng)立馬放入超淨工作台内。

　　須注意的事項有：外套、書包等物品，易附著(zhe)豐富的微生物，不應帶(dài)入細胞房。

　　培養(yǎng)操作中——

　　⑴台面布置：按實驗需要和個人習慣，合理放置試劑、耗材、儀器等物品；點(diǎn)燃酒精燈(dēng)後開始實驗操作。

　　⑵操作：靠近火焰進行實驗操作；試劑瓶經火焰旋轉灼燒後打開；挑選吸管，快速的縱向在火焰上來回移動並(bìng)做180°旋轉；将試劑瓶向吸管傾斜，吸出所需的液體量；灼燒瓶頸後，重新蓋上蓋子；等所有操作完畢(bì)後，擰緊瓶蓋。

　　須注意的事項有：操作要準確(què)、敏捷、有序；吸取溶液時，應專管專用，避免交叉污染；吸管管口要向下傾斜，以防止液體倒流進入移液器内發生污染；盡量減少細胞和培養基的敞口時間；已開口的試劑瓶盡可能的傾斜放置，防止下落微生物的污染；避免在敞口的細胞培養皿及培養皿蓋上方操作；不要面對(duì)工作台或細胞培養箱講話或咳嗽，防止口腔微生物随唾沫飛入而發生污染；若發生外溢
，用蘸有消毒酒精的棉球及時擦去。

　　培養操作後

　　⑴整理：将試劑放回原來的存儲(chǔ)位置；整理工作台面，物歸原位，合理丢棄廢(fèi)液和廢(fèi)物。

　　⑵消毒：用消毒酒精擦拭台面；打開超淨(jìng)工作台和細胞房的紫外燈(dēng)，照射至少15min。

　　須注意的事項有：紫外燈(dēng)開啓後，人不能進入，紫外線對眼睛和裸露的皮膚均有危害，若要進入，一定要先關閉(bì)紫外燈(dēng)，待人離開後打開。

　　二、環境

　　如果操作者技術規範且操作嚴謹，那麽當(dāng)環境惡化時，也會導(dǎo)緻污染風險的增加。進行細胞培養時，環境必須潔淨。

　　恒溫恒濕培養箱——細胞污染一個主要的途徑就是恒溫恒濕培養箱。恒溫恒濕培養箱，在培養細胞取出和放入的過程中，直接與空氣接觸，微生物會被夾帶進入；加之其内部濕度高、溫度适宜，特别有利於(yú)真菌繁殖。細胞培養瓶或培養皿，如果接觸瞭(le)操作台以外的地方，在放入培養箱前須經消毒酒精擦拭。但須注意的是，消毒酒精要經操作台吹幹，否則會導緻培養箱内乙醇濃度升高，酒精會影響細胞的正常功能。

　　在很多情況下，細胞培養必須使用恒溫恒濕培養箱。爲瞭(le)有效的控制該污染途徑，可採取的措施有：①在加濕托盤内添加真菌抑制劑，如硫酸銅、十二烷基磺酸鈉，可抑制托盤内真菌的生長；亦或盛裝無菌的去離子水，並(bìng)每周進行更換，托盤用消毒酒精或高溫滅菌的方法進行嚴格的清潔；②使用無毒抗真菌清潔劑對培養箱内外進行定期清潔，先用清潔劑、再用消毒酒精進行擦拭；爲不留死角，清潔前應将培養箱内部能拆卸的部件都拆卸下來，清潔時也特别要注意不能拆卸的犄角旮旯處；③不正確的使用空氣過濾器，那将變爲培養箱一個可怕的污染途徑，故須按使用說明定期更換空氣過濾器；④在使用過程中，任何溢出液必須立刻用消毒酒精清除幹淨；⑤一旦發現培養物被污染，立馬清走。